Navoakan'i Peter Sarnow, Stanford University School of Medicine, Stanford University, California, nankatoavina tamin'ny 25 Desambra 2020 (naverina tamin'ny 25 Oktobra 2020)
Mitatitra ny fifampikasohana eo amin'ny subunits amin'ny famerenana ny complexes-transcription coronaviruses izahay, izay tena ilaina amin'ny replication sy ny fiarovana ny evolisiona.Nanome porofo izahay fa ny sehatra NiRAN mifandray amin'ny nsp12 dia manana hetsika transferase nucleoside monophosphate (NMP) amin'ny trans, ary nanondro ny nsp9 (proteinina mifamatotra RNA) ho lasibatra.Ny NiRAN dia mampiakatra ny fampifandraisana kovalen'ny NMP amin'ny terminal amino nsp9 voatahiry amin'ny fanehoan-kevitra izay miankina amin'ny ion Mn2+ sy ny sisa tavela amin'ny Asn voatahiry.Hita fa ny hetsika NiRAN sy ny nsp9 NMPylation dia tena ilaina amin'ny replication coronavirus.Ny angon-drakitra dia ahafahantsika mampifandray an'io hetsika io amin'ny marika anzima viriosy nested amin'ny fandinihana teo aloha ao amin'ny vinavina fa ny fanombohana ny RNA synthesis amin'ny kilasin'ny viriosy RNA dia mifanaraka amin'ny fomba fiasa sy ny evolisiona.
Ny RNA polymerase (RdRps) miankina amin'ny RNA an'ny Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae, ary fianakaviana 12 hafa) dia mifamatotra amin'ny sehatra amino-terminal (N-terminal) ao amin'ny proteinina tsy ara-drafitra (nsp) navoaka tamin'ny polyprotein, antsoina hoe NiRAN Ny 1ab dia ahitana protease lehibe viriosy (Mpro).Teo aloha dia notaterina ny hetsika GMPylation/UMPylation an'ny arterial NiRAN-RdRp nsp, ary naroso ny hamokatra transient amin'ny famindrana ny nucleoside monophosphate (NMP) mankany amin'ny virus (tsy fantatra ankehitriny) sy/na cell biopolymerization Things.Eto, asehontsika fa ny coronavirus (Human Coronavirus [HCoV]-229E sy Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) dia manana Mn2+-miankina amin'ny NMPylation, izay avy amin'ny nsp9 amin'ny alàlan'ny fananganana Mpro-mediated nsp9 After. ny N-terminal flanking nsps dia navoaka proteolytically, ny phosphoramidate dia mifamatotra amin'ny amine voalohany (N3825) ao amin'ny N-terminal ny nsp9.Uridine triphosphate no nucleotide tiana indrindra amin'ity fanehoan-kevitra ity, fa ny adenosine triphosphate, guanosine triphosphate, ary cytidine triphosphate dia mety koa ny co-substrates.Ny fandinihana ny mutation mampiasa proteinina nsp9 sy nsp12 recombinant ary ny mutant HCoV-229E novolavolaina dia namaritra ny sisa tavela ilaina amin'ny NSP9 NMPylation sy ny replication virus amin'ny kolontsaina sela.Ny angon-drakitra dia nanamafy ny vinavinan'ny sisa tavela amin'ny tranokala mavitrika NiRAN ary namaritra ny anjara toerana lehibe amin'ny sisa tavela nsp9 N3826 amin'ny nsp9 NMPylation sy ny replication virus in vitro.Ity ambiny ity dia ampahany amin'ny filaharan'ny N-terminal NNE tripeptide voatahiry ary voaporofo fa izy irery no sisa tavela amin'ny nsp9 sy ny homologs ao amin'ny fianakaviana coronavirus.Ity fanadihadiana ity dia manome fototra mafy orina ho an'ny fandalinana ny asan'ny NMPylation amin'ny viriosy hafa misy akany ary manolotra tanjona mety ho an'ny fampivoarana fanafody antiviral.
Nidovirales positive-stranded RNA virus infected isan-karazany vertebrates sy invertebrates (1, 2).Ny baiko amin'izao fotoana izao dia ahitana fianakaviana 14 (3), izay nodinihina lalina tao anatin'ny 20 taona lasa ny fianakaviana Coronavirus.Tamin'izany fotoana izany dia nisy coronaviruses zoonotic telo nipoitra avy amin'ny mpampiantrano biby ary niteraka fihanaky ny aretina taovam-pisefoana mahery vaika tamin'ny olombelona.Anisan'izany ny areti-mifindra maharitra vokatry ny areti-mifindra mahery vaika.Syndrome respiratoire Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Ny Nidovirus dia mizara fikambanana génomika iray, ary ny subunit amin'ny complexe-transcription-transcription membrane-bound (RTC) dia voakodia ao amin'ny 5-?²-terminal roa ampahatelony sy ny subunit ara-drafitra lehibe amin'ny virosy, ary koa ny fitaovana sasany. .Proteinina, voakodia ao amin'ny 3??² faran'ny ampahatelon'ny genome (1).Afa-tsy ho an'ny fianakaviana iray misy viriosy planaria (Monoviridae) (8), ny viriosy misy akany rehetra dia manodinkodina ny subunits RTC amin'ny rindran-damina roa lehibe (ORF) ORF1a sy ORF1b, izay nadika avy amin'ny RNA génomika an'ny.Ny ORF1a dia manodinkodina polyprotein (pp) 1a, ary ORF1a sy ORF1b dia miara-mampiditra pp1ab.Miaraka amin'ny fandraisan'anjaran'ny protease lehibe (Mpro) voahodidin'ny ORF1a, ny pp1a sy ny pp1ab dia voahodina ho proteinina tsy ara-drafitra (nsps), antsoina koa hoe 3CLpro, satria manana homolojia miaraka amin'ny 3Cpro an'ny picornavirus ( 9).Ireo nsps ireo dia heverina fa miangona ao anaty RTC mavitrika lehibe, manangana ny synthesis ny RNA génomika (replication) sy ny RNA subgenomic (transcription), ary ampiasaina mba handrindrana ny fanehoana ny ORF izay hita any ambanin'ny ORF1b (10? ? ?12).
Ny RTC fototra dia misy RNA-miankina amin'ny RNA polymerase (RdRp) (13), superfamily 1 helicase (HEL1) (14, 15) ary enzymes fanodinana RNA maromaro, izay voarakitra indrindra ao amin'ny ORF1b sy ao amin'ny fianakaviana coronavirus Misy nsp12-nsp16 ary nsp9-nsp12 ao amin'ny fianakaviana Arterioviridae (jereo ny references 10ââ 12).Ny RdRp sy ny HEL1 dia maneho faritra roa (ampahiminy) voatahiry amin'ny viriosy akanin'ny vorona ary manana homolojia amin'ireo viriosy RNA hafa.Ny replicase fototra dia inoana fa manampy amin'ny subunit hafa, ao anatin'izany ny nsps kely maromaro navoaka avy amin'ny faritra carboxy-terminal (C-terminal) an'ny pp1a, midina ny Mpro (coronavirus nsp5 sy arterial virus nsp4, tsirairay avy).Izy ireo dia manana fiarovana manokana ho an'ny fianakaviana sy hetsika samihafa (jereo ao amin'ny reference 10ââ12).
Vao tsy ela akory izay, nisy sehatra iray manana toetra mampiavaka ny motif filaharana tsy manam-paharoa hita ao amin'ny faran'ny amino (N-terminus) mifanila amin'ny RdRp amin'ny viriosy misy akany rehetra, fa tsy misy viriosy RNA hafa (16).Miorina amin'ny toerana misy azy sy ny hetsika nucleotide transferase (nucleoside monophosphate [NMP] transferase), ity sehatra ity dia nomena anarana hoe NiRAN (Nestvirus RdRp-related nucleotide transferase).Ny fitambaran'ny sehatra roa an'ny NiRAN-RdRp dia nsp12 ao amin'ny fianakaviana Coronaviridae sy nsp9 ao amin'ny fianakaviana Arterioviridae, ary amin'ny nestoviridae hafa, ny NiRAN-RdRp dia antenaina havoaka ho nsp tsy miankina amin'ny polyprotein viral.Ao amin'ny coronavirus, ny sehatra NiRAN dia misy sisa tavela 1/450 ary mifandray amin'ny sehatra C-terminal RdRp amin'ny alàlan'ny faritra mpampitohy (16?19).Ao amin'ny Equine Arteritis Virus (EAV) (Arteriviridae), ny recombinant nsp9 dia mampiseho ny Mn2+ ion-dependent (tena) UMPylation sy ny hetsika GMPylation, izay miankina amin'ny fototra telo voatahiry ao amin'ny nestovirus, AN, BN ary CN Ny sisa tavela amin'ny filaharana.Aiza ny N dia midika hoe NiRAN) (16).Ny sisin'ny N-terminal amin'ireo motif ireo dia motif tsy mpandala ny nentin-drazana preAN.Ny sasany amin'ireo sisa tavela ireo dia voatahiry ao amin'ny kinase proteinina mifandray lavitra, izay naseho fa tafiditra amin'ny fatorana sy ny catalytika nucleoside triphosphate (NTP) (20, 21).Mifanaraka amin'ity fanamarihana ity, ny sisa tavela amin'ny tranokala mavitrika ao amin'ny pseudokinase SelO avy amin'ny Pseudomonas syringae dia azo atambatra miaraka amin'ny supercomplex SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 vao haingana.Ny sisa tavela amin'ny Coronavirus NiRAN voatahiry ao amin'ny microstructure elektronika.Recombinant proteinina (17).Tombanana fa ny U / GMPylation voarakitra an-tsoratra (tena) dia hamokatra fanjakana mandalo hamindra NMP amin'ny substrate (tsy fantatra ankehitriny) (16), ary ny fitoviana ara-drafitra eo amin'ny NiRAN sy protein kinase (17, 19) ) Dia ny fiheverana fa NiRAN dia manova proteinina hafa.
Ny endri-javatra maro, anisan'izany ny fikambanany tsy manam-paharoa sy tsy manam-paharoa miaraka amin'ny viriosy misy akany sy ny fisarahan'ny fototarazo amin'ny RdRp, no mahatonga an'i NiRAN ho anzima mifehy tena manan-danja ho an'ny viriosy misy akany, izay tena zava-dehibe amin'ny fipoiran'izy ireo sy ny maha-izy azy.Talohan'izay dia nisy asa telo mety ho an'ny NiRAN hifehy ny fandikana genome/subgenomic na replication/transcription.Rehefa dinihina ny angon-drakitra zara raha misy sy tsy feno tamin'izany fotoana izany dia samy manana ny tombony sy ny fatiantoka ny asa tsirairay (16).Amin'ity fikarohana ity dia mikendry ny hanambatra ny fandalinana fototarazo biochemika sy mivadika amin'ny coronaviruses misolo tena ireo karazany roa izahay, ary mametraka ny zavatra hitanay ao amin'ny evolisiona momba ny fiovan'ny natioran'ny fianakaviana coronavirus, mba hahazoana fahalalana momba ity fanjakana mistery ity.Mitatitra ny fandrosoana lehibe amin'ny fahatakarana ny NiRAN izahay amin'ny alàlan'ny famantarana ireo tanjona voajanahary ao amin'ny RTC, izay (ao anatin'ireo vinavina telo misy) dia mandray anjara amin'ny anjara asan'ity sehatra ity amin'ny fanombohana ny synthesis ny virus RNA nested.Ity fikarohana ity koa dia manokatra ny mety ho an'ny anjara asa hafa an'ny NiRAN amin'ny interface host virus.
Mba hamaritana ny toetran'ny enzymatic amin'ny sehatra NiRAN mifandraika amin'ny virus corona nsp12, dia namokatra endrika recombinant an'ny olombelona coronavirus 229E (HCoV-229E) nsp12 ao amin'ny E. coli izahay, misy marika His6 eo amin'ny C-terminus, ary natambatra ny proteinina miaraka amin'ny [α32-P ] Mitsambikina miaraka amin'ny NTP eo anatrehan'ny MnCl2 araka ny voalaza ao amin'ny Materials and Methods.Ny famakafakana ny vokatra fanehoan-kevitra dia nanondro ny fisian'ny proteinina radiolabeled miara-mifindra monina miaraka amin'ny nsp12 (106 kDa), izay manondro fa ny coronavirus nsp12 dia manangana ny fiforonan'ny covalent proteinina-NMP addducts, kokoa niforona tamin'ny uridine monophosphate (UMP) (sary 1A) Ary B).Ny famakafakana quantitative dia nampiseho fa raha oharina amin'ny nucleotides hafa, dia nitombo in-2 hatramin'ny in-3 ny hamafin'ny famantarana ny fampidirana UMP (sary 1C).Ity angon-drakitra ity dia mifanaraka amin'ny hetsika famindrana NMP amin'ny faritra NiRAN an'ny coronavirus (16), saingy manondro fa tsy mitovy ny safidin'ny nucleotide amin'ny sehatra NiRAN an'ny coronavirus sy ny virus arterial.
Hetsika self-NMPylation an'ny HCoV-229E nsp12.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) dia nampidirina tamin'ny [α-32P] NTP voatondro teo anatrehan'ny 6 mM MnCl2 nandritra ny 30 minitra (jereo ny fitaovana sy ny fomba ho an'ny antsipiriany).Ny vokatra fanehoan-kevitra dia nosarahan'ny SDS-PAGE ary nolokoina tamin'ny manga mamirapiratra Coomassie.(B) Ny proteinina radiolabeled dia aseho amin'ny alàlan'ny sary phosphore.Ny toeran'ny nsp12-His6 sy ny mari-pamantarana molekiola proteinina (amin'ny kilodaltons) dia aseho amin'ny A sy B. (C) Ny hamafin'ny mari-pamantarana radioaktifa (midika ± SEM) dia nofaritana tamin'ny fanandramana tsy miankina telo.*P≤0.05.Ny tanjaky ny famantarana (isan-jato) dia mifandraika amin'ny UTP.
Na dia hita fa tena ilaina amin'ny famerenana ny EAV sy SARS-CoV amin'ny kolontsaina sela (16) ny hetsika anzima mifandraika amin'ny NiRAN (16), dia tsy mbola voafaritra ny fiasan'ny NiRAN manokana sy ny mety ho tanjona.Ny fitoviana ara-drafitra vao haingana teo amin'ny NiRAN sy ny fianakavian'ny proteinina miaraka amin'ny vala misy proteinina kinase (17, 22) dia nanosika anay hanandrana ny fiheverana fa ny NiRAN dia mampiakatra ny NMPylation ny proteinina hafa.Namorona andiana lasibatra homologous izahay, anisan'izany ny proteinina tsy ara-drafitra nofehezin'ny HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), izay samy misy marika C-terminal His6 (SI appendix, Table S1) , Ary Atsipazo ireo proteinina ireo miaraka amin'ny [α32-P] uridine triphosphate ([α32-P] UTP) raha misy na tsy misy nsp12.Ny albumin serum bovine sy ny proteinina fusion MBP-LacZα novokarina tao amin'ny E. coli dia natao ho fanaraha-maso (sary 2A, lalana 1 hatramin'ny 7).Ny proteinina radiolabeled dia nodinihina tamin'ny alàlan'ny electrophoresis gel sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE) sy autoradiography, ary hita fa misy famantarana radioaktifa matanjaka amin'ny fanehoan-kevitra misy nsp12 sy nsp9.Ny toeran'ny famantarana dia mifanaraka amin'ny molekiolan'ny nsp9, izay manondro ny nsp12-mediated UMPylation ny nsp9 (sary 2B, lalana 7).Tsy nisy proteinina fitsapana hafa hita fa UMPylated, izay nahatonga anay hanatsoaka hevitra fa ny nsp9 dia substrate manokana an'ny nsp12.Mifanaraka amin'ny angon-drakitra momba ny tena NMPylation aseho amin'ny sary 1, ny nsp12 dia afaka mamindra ny NMP efatra amin'ny nsp9, na dia tsy mitovy aza ny fahombiazany, UMP> adenosine monophosphate (AMP)> guanosine monophosphate (GMP)> cytidine monophosphate (CMP) ) ( Sary).3 A sy B).Eo ambanin'ny fepetra ampiasaina amin'ity assay ity (fohy ny fanehoan-kevitra sy ny fotoana fandefasana, mampihena ny fifantohana amin'ny nsp12; fitaovana sy fomba), tsy hita ny NMPylation ny nsp12 tena (ampitahao ny sary 2B, lalana 7, ary sary 1B), izay voaporofo fa mahomby (Ary fihodinana maro) UMP nifindra avy amin'ny nsp12 ho nsp9.Ny hetsika transferase UMP dia mitaky ny fisian'ny ion Mn2 +, araka ny aseho amin'ny sary 3C, raha ny hetsika UMP transferase kely indrindra dia voamarika eo anatrehan'ny Mg2 +, ary tsy misy hetsika eo anatrehan'ireo cations divalent roa hafa nosedraina.Ny angona mitovy amin'izany dia azo tamin'ny fitsapana NMPylation misy cytidine triphosphate (CTP), guanosine triphosphate (GTP), ary adenosine triphosphate (ATP) (SI appendix, Figure S1).
HCoV-229E nsp12-mediated UMPylation ny nsp9.Andiam-proteinina substrate (anisan'izany ny albumin serum bovine, MBP-lacZα, ary andian-dahatsoratra HCoV-229E nsps misy soratra miaraka amin'ny C-terminal His6 voarakotry ny ORF1a) dia nampiasaina hanombanana ny hetsika UMPylation an'ny HCoV-229E nsp12-His6⁺-mediated. proteinina.Atsipazo ny proteinina miaraka amin'ny [α-32P] UTP mandritra ny 10 minitra raha tsy misy (A) na misy (B) nsp12 araka ny voalaza ao amin'ny fitaovana sy ny fomba.Eo an-tampon'ny A sy B, ny gel SDS-polyacrylamide voaloto amin'ny Coomassie Brilliant Blue dia aseho, ary eo amin'ny farany ambany amin'ny A sy B dia aseho ny autoradiograms mifanaraka amin'izany.Ny toeran'ny marika molekiola proteinina (amin'ny kilodaltons) dia omena eo ankavia.Ny toeran'ny nsp12-His6 (B, ambony) sy ny mari-pandrefesana radioaktifa voamarika nandritra ny fampidirana ny nsp12-His6 miaraka amin'ny nsp9-His6 (B, lane 7) dia aseho ihany koa, izay manondro fa [α-32P] UMP mankany nsp9-His6 (12.9 kDa), izay tsy voamarika ho an'ny proteinina hafa nosedraina.
HCoV-229E NiRAN-mediated biochemika sy virolojika ny nsp9 NMPylation.(A sy B) Ny anjara asan'ny co-substrate nucleotide ampiasaina amin'ny fanehoan-kevitra.Ny Nsp12-His6 sy ny nsp9-His6 dia mifangaro ary mipoitra eo anatrehan'ny NTPs [α-32P] samihafa amin'ny fitsapana NMPylation mahazatra.(A, ambony) Coomassie-stained nsp9-His6 nosarahan'ny SDS-PAGE.(A, ambany) Autoradiograph amin'ny faritra mitovy amin'ny gel.(B) Ny hetsika mifandraika (midika ± SEM) eo anatrehan'ny cofactor nucleotide voatondro dia voafaritra amin'ny fanandramana tsy miankina telo.*P≤0.05.(C) Ny anjara asan'ny ion metaly.Aseho ny fitsapana NMPylation mahazatra amin'ny fisian'ny [α-32P] UTP sy ny ion metaly samihafa, samy manana fifantohana 1 mM.Ao amin'ny C, ny ambony, Coomassie stained nsp9-His6 dia aseho, ary ao amin'ny C, ny ambany, ny autoradiography mifanaraka amin'izany.Ny haben'ny proteinina voamarika (amin'ny kilodaltons) dia aseho eo ankavian'ny A sy C. (D) Ny endrika mutant an'ny HCoV-229E nsp12-His6 mitondra ny fanoloana asidra amino voatondro dia ao amin'ny [α-32P]UTP, araka ny voalaza amin'ny fitaovana sy ny fomba.Ny radiolabeled nsp9-His6 novokarina tamin'ny fanehoan-kevitra NMPylation dia hita amin'ny alàlan'ny phosphorylation imaging (D, ambony).Ny hetsika mifandraika raha oharina amin'ny proteinina karazana (wt) dia aseho amin'ny D, ary ny ambany dia raisina ho salan'isa (± SEM) avy amin'ny fanandramana tsy miankina telo.Ny asterisk dia manondro ny fanoloana ny sisa tsy voatahiry.(E) Ny titer otrik'aretina ao amin'ny supernatant kolontsaina amin'ny sela p1 dia azo 24 ora taorian'ny nahitana ny aretina tamin'ny alàlan'ny fitiliana plaque.Ny fanoloana kodon ao amin'ny sehatra NiRAN an'ny mutant HCoV-229E namboarina dia aseho (mifototra amin'ny toerana misy azy ao amin'ny pp1ab ny laharan'ny ambiny).Ny tranokala mavitrika RdRp tsy ampy replication nsp12_DD4823/4AA dia nampiasaina ho fanaraha-maso.
Mba hahazoana fahatakarana lalindalina kokoa ny tranokala mavitrika an'ny NiRAN sy hamaritana ny sisa tavela mifandraika amin'ny hetsika nsp9-specific NMP transferase, dia nanao fanadihadiana momba ny mutation izahay, izay nanoloranay ny sisa tavela tamin'ny NiRAN AN, BN ary CN motifs ( 16) Ala (SI appendix, sary S2).Ankoatr'izay, ny fiantraikan'ny fanoloana Arg-to-Lys mpandala ny nentin-drazana na Lys-to-Arg dia nodinihina tamin'ny tranga roa.Amin'ny maha-fifehezana (ratsy) azy dia soloina Ala ny ambiny izay tsy voatahiry na latsaka ao amin'ny faritry ny coronaviruses NiRAN sy ireo viriosy hafa manana akany. Manolo ny K4116A (ao amin'ny motif preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motif). BN) sy D4280A (CN) dia mampihena na manafoana ny nsp9 NMPylation amin'ny alàlan'ny nsp12, raha ny proteinina miaraka amin'ny fanoloana mpandala ny nentin-drazana (R4178K), K4116R) dia mitazona 60% sy 80% amin'ny asany, izay manondro fa ny fanalefahana ny fameperana amin'ny lafiny tsirairay. saro-pady ara-batana (sary 3D) ny rojo.Ny fanoloana ny sisa tavela maro hafa voatahiry E4145A, D4273A, F4281A ary D4283A dia tsy dia mampidi-doza kokoa, ary ny nsp9 UMPylation dia mihena tsikelikely.Ny vokatra mitovy amin'izany dia azo tamin'ny fanehoan-kevitra nsp9 NMPylation mifandraika amin'ny NTPs hafa (sary 3D sy SI appendix, sary S3), izay manamafy fa ny vokatra voamarika amin'ny fanoloana asidra amine manokana dia tsy miankina amin'ny karazana co-substrate nucleotide ampiasaina.Manaraka izany, nosedrainay ny mety ho fiantraikan'ireo fanoloana nsp12 ireo amin'ny famerenana ny coronaviruses amin'ny kolontsaina sela.Ho an'ity tanjona ity dia nampiasa ny maodely ADN (cDNA) famenon'ny génétique mifanentana amin'ny virosy vaccinia recombinant (23, 24) izahay mba handikana sela 5 -7.Ny titration ny taranaka otrik'aretina vokarina ao amin'ireo sela ireo dia mampiseho fa ny ankamaroan'ny HCoV-229E NiRAN mutants dia tsy azo atao (sary 3E).Vondrona mutant virosy tsy mahavelona dia ahitana safidy hafa izay naseho hanafoana na hampihena be ny asa famindrana ny NMP in vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), saingy misy safidy roa hafa (K4116R, E4145A) 8 % voatokana?Ny hetsika NMPylation in vitro dia manondro fa misy fameperana fanampiny tafiditra.Toy izany koa, ny fiovan'ny roa hafa (R4178K, F4281A) izay nahatonga ny fihenan'ny antonony amin'ny hetsika NMPylation in vitro an'i NiRAN dia niteraka viriosy velona, na izany aza, ireo viriosy ireo dia nampihena be ny titer tamin'ny alàlan'ny replication.Mifanaraka amin'ny angon-drakitra hetsika in vitro aseho amin'ny sary 3D, manolo ireo sisa tavela efatra hafa izay tsy voatahiry amin'ny coronavirus sy/na viriosy misy akany hafa (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) dia niteraka viriosy mahavelona. ny titer somary mihena raha oharina amin'ny viriosy karazana bibidia (sary 3E).
Mba handinihana raha miankina amin'ny sehatra RdRp mavitrika ny asan'ny NMP transferase mpanelanelana amin'ny NiRAN, dia nosoloina Ala ny sisa tavela Asp roa voatahiry tafiditra amin'ny fandrindrana ny ion metaly divalent (11) ao amin'ny RdRp motif C. Ny proteinina nsp12_DD4823/4AA dia mitazona ny hetsika nsp9 NMPylation, izay manondro fa ny hetsika nsp12-mediated in vitro nsp9 NMPylation dia tsy mitaky hetsika polymerase (SI Appendix, sary S4).
Taorian'ny nananganana ny hetsika NMP- nsp9-specific NMP transferase ho an'ny nsp12, dia nanandrana nanamarika ny fampidirana NMP-nsp9 izahay amin'ny alàlan'ny spectrometry faobe (MS).Ny spektrum faoben'ny proteinina feno amin'ny HCoV-229E nsp9 recombinant dia nampiseho tampony tamin'ny 12,045 Da (sary 4A).Ny fanampiana ny nsp12 dia tsy nanova ny kalitaon'ny nsp9, izay manondro fa ny nsp12 sy ny nsp9 dia tsy hamorona complexe stable eo ambanin'ny fepetra ampiasaina (denaturation) (sary 4A).Raha eo anatrehan'ny UTP sy GTP, ny fandrefesana faobe ny fanehoan-kevitra misy nsp9 sy nsp12 tsirairay avy dia nampiseho fa ny proteinina mason'ny UTP nifindra 306 Da, ary ny proteinina mason'ny GTP nifindra 345 Da, izay manondro fa ny tsirairay nsp9 molekiola mamatotra UMP na GMP. (Sary 4) C sy D).Tombanana fa ny angovo ilaina amin'ny NiRAN-mediated nsp9 NMPylation dia avy amin'ny hydrolysis NTP sy ny famoahana pyrophosphate.Na dia mihoatra ny 10 heny aza ny nsp9 (kendrena) noho ny nsp12 (enzyme) no nampiasaina tamin'io fanehoan-kevitra io, dia nisy NMPylation ny nsp9 saika feno, izay manondro fa ny fifandraisana eo amin'ny nsp12 sy ny nsp9 dia tsy maharitra, ary ny nsp12 dia afaka NMPylate bebe kokoa nsp9. in vitro molekiola.
Single NMPylation ny nsp9 amin'ny fisian'ny nsp12 sy UTP na GTP.Aseho ny spektrum faobe proteinina feno deconvoluted an'ny HCoV-229E nsp9 (SI appendix, Table S1) (AD).(A) nsp9 irery, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 eo anatrehan'ny UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 eo anatrehan'ny GTP.
Mba hamaritana ny sisa tavela nsp9 UMPylated tamin'ny nsp12, nsp9-UMP dia nopetahana tamin'ny trypsin.Ny peptides vokatr'izany dia nosarahan'ny nano-high performance liquid chromatography (HPLC) ary nodinihina tamin'ny tandem mass spectrometry (MS/MS) an-tserasera.Ny famakafakana ny angona amin'ny fampiasana ny fonosana rindrambaiko Byonic (Protein Metrics) dia nampiseho UMPylation ny asidra amine N-terminal.Izany dia voamarina amin'ny tanana.Ny spektrum faobe tandem an'ny peptide precursor [UMP] NNEIMPGK (SI appendix, Figure S5A) dia nanambara sombiny tamin'ny 421 m / z, izay manondro fa ny UMP dia mifatotra amin'ny 1 sisa amin'ny nsp9.
Ao amin'ny N-terminus an'ny nsp9, Asn dia voatahiry ao anatin'ireo mpikambana ao amin'ny Orthocoronavirinae (SI appendix, sary S6).Na dia mino aza izahay fa ny nitrogen amine voalohany N-terminal no mety ho mpandray ny UMP, dia nanapa-kevitra ny hahazo porofo fanampiny momba ny NMP mifatotra amin'ny N-terminal izahay.Noho izany antony izany, ny non-NMPylated sy NMPylated N-terminal peptide nsp9 nodiovin'ny HPLC dia azo avy amin'ny fisian'ny acetone sy ny sodium cyanoborohydride.Ao anatin'ireo fepetra ireo, ny amine voalohany maimaim-poana ihany no azo ovaina amin'ny propyl (25).Ny peptide avy amin'ny N-terminal nsp9 miaraka amin'ny filaharana NNEIMPGK dia misy amine roa voalohany, ny iray amin'ny N-terminus an'ny Asn ary ny iray amin'ny rojo an'ny Lys amin'ny C-terminus.Noho izany, ny vondrona propyl dia azo ampidirina amin'ny tendrony roa.Ny chromatograms ion nalaina avy amin'ny peptides tsy NMPylated dia aseho ao amin'ny appendix SI, sary S5B.Araka ny efa nampoizina, dia azo fantarina ny N-terminal sy C-terminal (mono) propylated (SI appendix, Sary S5B, lalana ambony) ary peptides dipropylated (SI appendix, Sary S5B, lalana ambany).Ity lamina ity dia miova amin'ny fampiasana ny peptide N-terminal NMPylated an'ny nsp9.Amin'ity tranga ity, ny C-terminal propylated peptides ihany no azo fantarina, fa ny N-terminal propylated peptides sy ny dipropylated peptides dia tsy fantatra (SI Appendix, Figure S5C), izay manondro fa ny UMP dia nafindra tany amin'ny N-terminal primary amine Mba hisorohana izany. vondrona tsy hanao fanovana.
Manaraka, manolo (miaraka amin'ny Ala na Ser) na mamafa ny sisa tavela amin'ny N-terminus an'ny nsp9 mba hamaritana ny teritery voafaritra manokana.Miorina amin'ny angon-drakitra MS izay mampiseho fa ny NiRAN dia mamorona adduct nsp9-NMP miaraka amin'ny amine voalohany amin'ny sisa tavela N-terminal an'ny nsp9, dia nihevitra izahay fa ny nsp9 NMPylation dia mitaky ny protease master viral (Mpro, nsp5) mba hamotsorana ny terminal nsp9 N polyprotein mialoha azy.Mba hitsapana an'io petra-kevitra io dia namokatra proteinina précursor nsp7-11 misy nsp9 ao amin'ny E. coli izahay ary nanao fitsapana NMPylation mahazatra amin'ny fisian'ny [α-32P] UTP (fitaovana sy fomba).Araka ny aseho amin'ny sary 5A (lalana 3), ny precursor nsp7-11 tsy voatapaka dia tsy misy radiolabeled amin'ny nsp12.Mifanohitra amin'izany kosa, raha ny nsp7-11 dia nopotehin'ny recombinant nsp5 mba hamotsorana ny nsp9 (sy ny nsps hafa) avy amin'ny mpialoha lalana, dia hita ny proteinina radiolabeled izay mifindra monina miaraka amin'ny nsp9, manamafy ny fanatsoahan-kevitray fa ny NiRAN sy N- Selective formation of covalent nsp9-NMP adducts .Ny amin'ny terminal voalohany amin'ny N-terminal Asn (toerana 3825 ao amin'ny pp1a/pp1ab).Ity fehin-kevitra ity dia tohanan'ny fanandramana mampiasa ny fananganana nsp9, izay misy sisa iray na roa fanampiny ao amin'ny N-terminus.Amin'ireo tranga roa ireo, dia nofoanana ny UMPylation nsp9-mediated NiRAN (SI Appendix, sary S7).Avy eo dia namokatra proteinina misy sisa tavela Asn iray na roa voafafa tamin'ny filaharan'ny peptide 3825-NNEIMPK-3832 tao amin'ny N-terminal nsp9.Amin'ireo tranga roa ireo, ny nsp9 UMPylation dia voasakana tanteraka (sary 5B), manome porofo fanampiny fa ny tena nsp9 N-terminus dia miasa ho mpandray NMP.
Ny fanodinana proteolytika ny nsp9 sy ny andraikitry ny sisa tavela N-terminal amin'ny UMPylation nsp12-mediated.(A) nsp9 UMPylation dia mila nsp9 N-terminal maimaim-poana.Ny Nsp7-11-His6 dia mipoitra mialoha amin'ny 30 °C ao amin'ny buffer detection NMPylation misy UTP amin'ny fisiana na tsy fisian'ny Mpro recombinant (nsp5-His6).Rehefa afaka 3 ora, atombohy ny NMPylation assay amin'ny fanampiana ny nsp12-His6 araka ny voalaza ao amin'ny Fitaovana sy ny fomba.Ny fanehoan-kevitra misy nsp5-His6 (lane 1) sy nsp9-His6 (lane 2) dia nampiasaina ho fanaraha-maso.Rehefa afaka 10 minitra, dia tapaka ny fanehoan-kevitra ary ny fangaro fanehoan-kevitra dia nosarahan'ny SDS-PAGE.Ny proteinina dia nolokoana tamin'ny Coomassie Brilliant Blue (A, ambony).Ny Nsp7-11-His6 mialoha sy ny vokatra novokarina avy amin'ny cleavage mediated nsp5-His6 dia aseho eo ankavanana.Mariho (noho ny habeny kely) fa ny nsp7 sy ny nsp11-His6 dia tsy hita amin'ity gel ity, ary ny fanehoan-kevitra dia ampiana amin'ny nsp5-His6 (lalana 1 sy 4; ny toeran'ny nsp5-His6 dia aseho amin'ny faribolana matevina) na ny nsp9-His6 (Lane 2) dia misy MBP kely (voatondro amin'ny faribolana misokatra) ho loto sisa tavela satria aseho ho proteinina fusion MBP (SI appendix, Table S1).(B) Ny variana Nsp9-His6 dia tsy manana sisa tavela amin'ny N-terminal Asn (ny laharan'ny tavela araka ny toerana ao amin'ny pp1a / pp1ab) ary voadio sy voadio amin'ny nsp12-His6 sy [α-32P] UTP.B, SDS-PAGE voaloto amin'ny Coomassie dia aseho eo an-tampony, B, ny autoradiographe mifanaraka amin'izany dia aseho eo ambany.Ny toeran'ny marika lanja molekiola (amin'ny kilodaltons) dia aseho eo ankavia.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-terminal sisa tavela dia nosoloina Ala na Ser, ary mitovy ny habetsaky ny proteinina ampiasaina amin'ny nsp12-His6 mediated UMPylation fanehoan-kevitra.Ny vokatra fanehoan-kevitra dia nosarahan'ny SDS-PAGE ary nolokoina tamin'ny Coomassie Brilliant Blue (C, ambony), ary ny radiolabeled nsp9-His6 dia hita tamin'ny alàlan'ny phosphorescence imaging (C, afovoany).Ny fampiasana proteinina karazana (wt) ho toy ny reference (napetraka amin'ny 100%), ny hetsika NMPylation (midika ± SEM) dia nokajiana avy amin'ny fanandramana tsy miankina telo.(D) Ny titre virosy ao amin'ny supernatant cellule p1 an'ny sela Huh-7 voan'ny sela HCoV-229E karazana Huh-7, ary ny mutant mitondra fanoloana asidra amine voatondro ao amin'ny nsp9 dia nofaritana tamin'ny alàlan'ny fitiliana plaque.Ny RdRp motif C double mutant DD4823/4AA dia nampiasaina ho fanaraha-maso ratsy.
Ny N-terminus an'ny nsp9 (indrindra ny toerana 1, 2, 3, ary 6) dia tena voaaro amin'ireo mpikambana ao amin'ny subfamily Orthocoronavirinae (SI appendix, sary S6).Mba handinihana ny mety ho anjara asan'ireo sisa tavela ao amin'ny nsp12-mediated nsp9 NMPylation, ny sisa Asn roa mifanesy ao amin'ny N-terminus an'ny nsp9 dia nosoloina Ala na Ser (irery na mitambatra).Raha ampitahaina amin'ny karazana wild-type nsp9, ny fanoloana ny N3825 amin'ny Ala na Ser dia niteraka fihenam-bidy avo roa heny amin'ny UMPylation nsp12-mediated (sary 5C).Mifanaraka amin'ny fehin-kevitray fa ny NMPylation dia mitranga ao amin'ny amine voalohany N-terminal fa tsy ny rojo an'ny sisa tavela amin'ny N-terminal, dia nahatsikaritra ny NMPylation sisa tavela izahay miaraka amin'ny fanoloana ny N3825A sy N3825S.Mahaliana fa raha soloina Ala na Ser ny Asn faharoa, dia mihena mafy kokoa ny UMPylation nsp9 (mihoatra ny in-10), fa ny fanoloana ny Ala amin'ny toerana 3, 4, ary 6 dia tsy misy fiantraikany amin'ny nsp9 UMPylation fotsiny (sary 2). ).5C).Ny vokatra mitovy amin'izany dia azo tamin'ny ATP, CTP na GTP (SI appendix, sary S8).Ireo angon-drakitra ireo dia manondro ny anjara toerana lehibe amin'ny N2826 (toerana 2 amin'ny nsp9) amin'ny nsp9 NMPylation.
Mba hahazoana porofo fanampiny momba ny fifandraisana misy eo amin'ny N-terminus nsp9 sy NMPylation, dia nanao fampifanarahana maromaro (MSA) an'ny filaharan'ny nsp9 an'ny fianakaviana Coronavirus (miovaova eo anelanelan'ny 104 sy 113 sisa) (SI Appendix, Figure. S6).Amin'ny fitambarany, amin'ny karazana 47 (fantatra sy azo lazaina) amin'ny karazana 5 amin'ny zana-pianakaviana Orthocoronavirinae izay mamindra ny biby mampinono sy ny vorona ary ny biby mandady, 8 sisa no hita fa tsy miova.Ny fiovana lehibe indrindra, anisan'izany ny famafana sy ny fampidirana, dia voamarika tamin'ny tsingerina teo amin'ireo singa ara-drafitra faharoa an'ny nsp9, araka ny voafaritry ny fandalinana ara-drafitra teo aloha (26 ??28).Sisa tsy miovaova dimy no hita tao amin'ny tady β sy α helix amin'ny ampahany C-terminal an'ny nsp9.Ny sisa tavela invariant telo no mandrafitra ny motif NNE amin'ny faran'ny N an'ny nsp9.Nambara fa ny Asn faharoa amin'ity motif ity no hany sisa tavela, izay zarain'ny nsp9 hypothetical an'ny coronavirus sahona mifandray lavitra, ary maneho ny karazana Microhyla letovirus 1 ao amin'ny subfamily Letovirinae an'ny Alphaletovirus.Ny fitehirizana ny sisa tavela ao amin'ny singa firafitry ny nsp9 faharoa dia azo atao amin'ny alàlan'ny fiheverana ara-drafitra mba hitazonana ny fananana mifatotra na fantatra amin'ny RNA.Na izany aza, toa tsy mihatra amin'ny fiarovana ny NNE io fisainana io, ary talohan'ity fandinihana ity, dia nanjavona tanteraka ny toetoetran'ny teritery izay mametra ny fiovaovan'ny filaharan'ny tripeptide.
Mba hamaritana ny maha-zava-dehibe ny nsp9-NMPylation sy ny fiarovana ny NNE amin'ny replication coronavirus, dia namokatra mutant HCoV-229E izahay, izay mitondra fanoloana tokana na indroa amin'ny sisa tavela nsp9 N-terminal, izay manondro fa ny nsp9 NMPylation dia manimba in vitro.Alohan'ny hanombohantsika dia manandrana mamaly ny fanontaniana isika raha misy fiantraikany amin'ny fanodinana proteolytika amin'ny faritra C-terminal pp1a ireo fanoloana ireo (eo akaikin'ny tranokalan'ny cleavage nsp8 | 9).Namboarina tao amin'ny E. coli ny andiana polyprotein nsp7-11 misy fanoloana mifanaraka amin'izany ao amin'ny N-terminus nsp9 ary notapatapahina tamin'ny Mpro recombinant.Ny fizarazaran'ny proteolytika amin'ireo toerana efatra (anisan'izany ny tranokala flanking nsp9) dia tsy misy fiantraikany amin'ny fanoloana nampidirina (SI appendix, sary S9), tsy tafiditra ao anatin'izany ny fiovana ara-drafitra amin'ireo proteinina izay manelingelina ny cleavage Mpro-mediated nsp8 | 9 (Na hafa) tranokala.
Ny sela Huh-7 dia nafindra niaraka tamin'ny RNA HCoV-229E génôma, manodina ny fanoloana Ala na Ser amin'ny tripeptides NNE (N3825, N3826, ary E3827) voatahiry ao amin'ny faran'ny nsp9 N, izay mampiseho fa ny ankamaroan'ny fiovana dia mahafaty.Afaka nanavotra ny viriosy izahay tamin'ny fanoloana ny Ser na Ala an'ny N-terminal Asn (N2835A na N2835S), saingy tsy nahomby tamin'ny famerenana ny viriosy niaraka tamin'ny fiovana tokana sy roa hafa ao amin'ny filaharana NNE (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS), E3827A) (sary 5D).
Ireo valiny ireo dia manondro fa ny replication ny coronaviruses amin'ny kolontsaina sela dia voafetra (mitovy na mitovitovy), mametra ny fiovan'ny voajanahary nsp9 NMPylation toerana ao amin'ny vatana, ary manohana ny anjara toerana lehibe amin'ity valinteny ity amin'ny tsingerin'ny fiainan'ny coronaviruses.
Tamin'ny andiany andrana farany dia namokatra C-terminal His6 misy soratra hoe SARS-CoV-2 nsp12 sy nsp9 izahay, ary endrika mutant roa nsp12 ao amin'ny E. coli.Ny sisa tavela amin'ny tranokala mavitrika ao amin'ny sehatra NiRAN sy RdRp dia samy mampiasa Ala (sary 6A sy SI appendix, Table S2).K4465 ao amin'ny SARS-CoV-2 nsp12 dia mifanitsy amin'ny K4135 ao amin'ny HCoV-229E (SI Appendix, sary S2), izay hita fa ilaina amin'ny hetsika NiRAN sy ny famerenana HCoV-229E (sary 3D sy E).Io sisa tavela io koa dia mifanitsy amin'ny viriosy arterial EAV nsp9 K94 residues, izay naseho teo aloha fa ilaina amin'ny NiRAN self-UMPylation / self-GMPylation (16).Araka ny aseho amin'ny sary 6B, ny SARS-CoV-2 nsp12 dia manana hetsika famindrana UMP amin'ny fampiasana nsp9 ho substrate, raha tsy mihetsika ny mutant site mavitrika nsp12_K4465A.Ny fanoloana indroa amin'ny filaharan'ny SDD an'ny RdRp motif C dia tsy misy fiantraikany amin'ny hetsika famindrana UMP (sary 6B), izay manondro fa ny hetsika RdRp dia tsy misy fiantraikany mivantana amin'ny nsp9 UMPylation.Ny angona mitovy amin'izany dia azo tamin'ny fampiasana CTP, GTP ary ATP (SI appendix, sary S10).Raha fintinina, ireo angon-drakitra ireo dia manondro fa ny NSP9 NMPylation nanelanelana an'i NiRAN dia manana hetsika mpandala ny nentin-drazana amin'ny coronaviruses izay misolo tena ny taranaka samihafa amin'ny subfamily orthocoronavirus.
SARS-CoV-2 nsp12-mpanelanelana amin'ny NMPylation nsp9.(A) Coomassie voaloko SDS-polyacrylamide gel mampiseho ny recombinant proteinina ampiasaina amin'ny fitsapana NMPylation.Ho fanaraha-maso, proteinina mutant misy fanoloana toerana mavitrika ao amin'ny sehatra NiRAN (K4465A) sy RdRp domain (DD5152/3AA) an'ny SARS-CoV-2 nsp12 no nampiasaina.Ny laharan'ny sisa dia mifototra amin'ny toerana ao amin'ny pp1ab.(B) Autoradiograph de UMPylation detection mampiasa nsp9-His6 sy [α-32P] UTP ho substrate nsp12-His6 (karazana wild [wt] sy mutant).Ny lanjan'ny molekiola (amin'ny kilodaltons) amin'ny proteinina misy marika dia aseho eo ankavia.
Ny sehatra NiRAN dia voatahiry amin'ny ankapobeny ao amin'ny Nidovirales (16), izay manondro fa izy ireo dia manangana ny fanehoan-kevitra enzymatic ilaina amin'ny replication Nidovirus.Tao anatin'ity fanadihadiana ity dia afaka nanaporofo izahay fa ny domaine NiRAN an'ny coronavirus dia mamindra NMP (vokatra avy amin'ny NTP) mankany amin'ny nsp9, proteinina mifono RNA mifatotra amin'ny virosy (26 ?? 29), mba hamaritana azy ho tanjona voajanahary ary mpiara-miasa amin'ny coronavirus RTC.
Ny sehatra NiRAN dia mizara motif telo misesy (AN, BN, ary CN), izay misy sisa tavela izay voatahiry ao amin'ny fianakaviana rehetra ao amin'ny filaharana Nidovirales monophyletic nefa tena samihafa (8, 16).Ny fandinihana vao haingana dia naneho fa misy ifandraisany amin'ny fianakaviana proteinina kinase-toy ny proteinina izy ireo, izay nantsoina voalohany hoe fianakaviana SelO (17, 19, 22, 30, 31).Ny proteinina mifandraika amin'ny SelO dia manana folika kinase, saingy tsy ampy ny sisa tavela amin'ny tranokala mavitrika amin'ny kinase klasika (22, 32).Mifototra amin'ny fihodinan'ny molekiola ATP mifamatotra amin'ny tranokala mavitrika ary miorina amin'ny fifandraisana manokana, SelO dia noheverina ary nohamafisina avy eo fa hamindra ny AMP (fa tsy phosphate) amin'ny substrate proteinina (22), raha misy proteinina SelO mitovy amin'ny YdiU kosa ny bakteria. vao haingana no naseho mba hanamafisana ny fametahana covalent ny UMP amin'i Tyr sy ny sisa tavela amin'ny substrate proteinina samihafa (33).
Mba hanamafisana sy hanitarana ny faminaniana momba ny sisa tavela amin'ny tranokalan'ny coronavirus NiRAN, dia nampiasa fomba biochemical sy reverse génétique izahay hanaovana fanadihadiana mutation amin'ny coronavirus nsp12 (sary 3D sy E ary SI appendix, sary S3 ary latabatra) S1â S4).Ny angon-drakitra dia mampiseho fa ny fanoloana ny HCoV-229E K4135, R4178 ary D4280 miaraka amin'i Ala dia manafoana ny hetsika in vitro NMP transferase sy ny famerenana ny viriosy amin'ny kolontsaina sela (sary 3D sy E ary SI appendice, sary S3), manohana ny fisiany ao amin'ny NTP γ-phosphate. (K4135, R4178) ary ny fandrindrana ny ion metaly toerana mavitrika (D4280).Ny fanoloana ny E4145A amin'ny Glu voatahiry ao amin'ny sahan'ny viriosy akanin'ny vorona voavinavina hanamafisana ny toerana K4135 (17) dia naseho hanafoanana ny replication virtoaly, saingy mahagaga fa voatazona ao amin'ny vitro NMPylation assay (sary 3D sy E sy E) ny hetsika. SI appendix, sary S3 sy tabilao S1–S4).Nisy fanamarihana mitovy amin'izany rehefa nampidirina tao amin'ny YdiU homolog an'i Salmonella typhimurium (E130A) (33) ny fanoloana mifanaraka amin'izany.Raha atambatra, ireo angon-drakitra ireo dia manohana ny asan'ny fanaraha-maso an'io sisa tavela voatahiry io fa tsy ny fiasan'ny catalytic.
Ny fanoloana ny sisa tavela amin'ny Phe (F4281A) voatahiry ao anatin'ny isan'ny nestovirus ao amin'ny sehatra HCoV-229E NiRAN (8) dia nitarika ny fihenan'ny hetsika NMPylation in vitro ary ny fihenan'ny viriosy amin'ny kolontsaina sela (sary 3D, E ary SI) appendice, sary S3).Ny angon-drakitra dia mifanaraka amin'ny asa manan-danja mifehy an'io ambiny io, toy ny DFG motif Phe sisa tavela teo aloha.Ao amin'ny kinase proteinina klasika, anisan'ny tadivavarana mifatotra Mg2+ izy io ary manampy amin'ny fanangonana sy fandrindrana ny hazondamosina???Ilaina amin'ny hetsika catalytic mahomby (32, 34).Ny fanoloana ny Ala sy Arg ho an'ny sisa tavela K4116 (ao amin'ny motif preAN), tsirairay avy, dia nesorina ny replication virtoaly ary, araka ny efa nampoizina, dia nisy fiantraikany samihafa teo amin'ny hetsika transferase NMP in vitro, miankina amin'ny rojo asidra amine nampidirina (sary 3D sy E ary SI appendice , sary S3).Ny angon-drakitra miasa dia mifanaraka amin'ny fampahalalana ara-drafitra, izay manondro fa io sisa tavela io dia nametraka fifandraisana amin'ny ATP phosphate (17).Ao amin'ny sehatry ny NiRAN an'ny fianakaviana otrik'aretina hafa, ny toeran'ny HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 dia nofehezin'i Lys, Arg na His (8), izay manondro fa nihena ny famerana ny famerana an'io sisa tavela manokana io.Ny fanoloana ny D4188A sy D4283A dia manafoana na mampihena mafy ny asan'ny enzyme ary manafoana ny replication virosy (sary 3).Ireo sisan-javatra roa ireo dia voatahiry amin'ny ankamaroan'ny viriosy (8), fa tsy ny rehetra, izay manondro asa manan-danja manokana ho an'ny fianakaviana saingy mety tsy misy catalytic.Ny fanoloana ala amin'ny sisa tavela Lys sy Asp (K4113A, D4180A, D4197A ary D4273A) izay tsy voatahiry ao amin'ny Coronaviridae na fianakaviana Nestioviridae hafa (8) dia nampiasaina ho fanaraha-maso.Araka ny efa nampoizina, dia azo leferina amin'ny ankapobeny ireo fanoloana ireo, miaraka amin'ny fihenan'ny hetsika anzima sy ny replication viraliny amin'ny tranga sasany (sary 3 sy SI appendix, sary S3).Amin'ny ankapobeny, ny angon-drakitra coronavirus mutagenesis dia mifanaraka tsara amin'ny angon-drakitra GMP-tena sy ny angon-drakitra momba ny génétique an'ny EAV NiRAN-RdRp (16), izay misy ny EAV nsp9 (coronavirus nsp12 ortholog) sisa K94 (mifanaraka amin'ny HCoV- 229E K4135) asa lehibe), R124 (mifanaraka amin'ny R4178), D132 (mifanaraka amin'ny D4188), D165 (mifanaraka amin'ny D4280), F166 (mifanaraka amin'ny F4281).Ho fanampin'izay, ny angon-drakitra mutagenesis HCoV-229E dia mifanaraka sy miitatra avy amin'ny angon-drakitra momba ny génétique mivadika SARS-CoV teo aloha (16), mitovy amin'ny hita amin'ny motif CN mifanaraka amin'izany Phe-to-Ala mutant SARS-CoV_nsp12 The phenotype voalaza -F219A sy HCoV-229E_F4281A (sary 3 D sy E ary SI appendix, sary S3 sy tabilao S1-S4).
Raha ampitahaina amin'ny orthologs EAV (16), izay manana safidy mazava ho an'ny UTP sy GTP (amin'ny fanehoan-kevitry ny NMPylation-tena), ny fandinihanay dia mampiseho fa ny sehatra coronavirus NiRAN (soloin'ny HCoV-229E sy SARS-CoV-2) dia mety mahomby. Nafindra ny NMP efatra, na dia misy safidy kely aza ny UMP (sary 1 sy 3).Ny mari-pamantarana somary ambany amin'ny co-substrate NTP manokana dia mifanaraka amin'ny rafitra supercomposite SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 vao haingana, izay misy ADP-Mg2+ mifatotra amin'ny toerana mavitrika amin'ny NiRAN, fa tsy amin'ny adenine Part. ny fananganana fifandraisana manokana (17).Ao amin'ny fandalinantsika, ny karazana nucleotide ampiasaina amin'ny fanehoan-kevitry ny NMPylation dia tsy misy fiantraikany amin'ny asan'ny proteinina mutant (SI Appendix, Figure S3), izay manondro fa tsy misy na iray aza amin'ireo sisa tavela mifandray akaiky amin'ny fatoran'ny nucleobase manokana.Mbola hohalalinina ny fototra ara-drafitra sy ny mety ho dikan'ny biôlôjika amin'ireo safidin'ny co-substrate NTP samihafa hita ao amin'ny sehatra NiRAN an'ny coronaviruses sy ny viriosy arterial;mety ho marina na mety ho noho ny fetran'ny fianarany tsirairay avy.Amin'izao fotoana izao, tsy azo lavina fa ny mety ho asan'ny NMPylator amin'ny virosy arterial NiRAN domain (raha ampitahaina amin'ny hetsika manokana NMPylation teo aloha) dia manana safidy hafa miaraka amin'ny substrate, amin'ny fiheverana fa ny fitoviana eo amin'ny arterial sy ny coronavirus. Ny sehatra NiRAN dia eo amin'ny fetrany.Ampitahao amin'ny filaharana (16).Raha ampitahaina amin'ny pseudokinase SelO, izay mampiasa Mg2+ ho cofactor, ny asan'ny coronavirus sy ny virosy arterial NiRAN dia miankina amin'ny Mn2 + (16) (sary 3C sy SI appendix, sary S1).Ny fiankinan-doha amin'ny Mn2 + sy ny safidy mazava ho an'ny UTP dia endri-javatra tsy mahazatra amin'ny proteinina NMPylators, ary vao haingana no voamarina tao amin'ny proteinina YdiU an'ny Salmonella typhimurium, izay manangana ny Mn2 +-miankina proteinina chaperone UMPylation mba hiarovana ny sela amin'ny fidiran'ny adin-tsaina Cell ATP dobo ( 33).
Ny fitoviana ara-drafitra vao haingana eo amin'ny sehatra coronavirus NiRAN sy ny kinase proteinina sela (17, 19) dia manome fanohanana fanampiny amin'ny fahafahan'i NiRAN mampifandray ny NMP amin'ny proteinina hafa notaterinay tamin'ity fanadihadiana ity.Nifantoka tamin'ny fikarohana ny mety ho lasibatra NiRAN izahay amin'ny proteinina voahodidin'ny HCoV-229E ORF1a, izay fantatra fa manampy mivantana na ankolaka ny dika mitovy amin'ny RTC ORF1b (12, 35).Ny andrana ataonay dia manome porofo mazava ho an'ny NMPylation mahomby sy manokana amin'ny nsp9 (sary 2).Raha ny proteinina kendrena dia ampiasaina amin'ny molar tafahoatra izay 8 ka hatramin'ny 10 heny noho ny an'ny anzima (nsp12), dia voamarina fa ny nsp9 dia tanteraka (mono) NMPized (sary 4).Nanatsoaka hevitra izahay fa ny fifandraisana misy eo amin'ny nsp12 sy ny nsp9 dia fohy ary tsy hamorona complexe stable miaraka amin'ny nsp9 (raha tsy misy subunits RTC hafa).Ity fehin-kevitra ity dia tohanan'ny fanadihadiana momba ny fifandraisan'ny proteinina momba ny proteome SARS-CoV (35).Ny fanadihadiana MS dia namaritra ny amine voalohany amin'ny sisa tavela amin'ny N-terminal nsp9 ho tranokala NMPylation (SI appendix, Figure S5).Ny fananganana ny fifamatorana phosphoramidate sy ny vondrona amino N-terminal dia manavaka ny asan'ny NMPylation NiRAN-mediated amin'ny fihetsiky ny AMPylation Pseudomonas syringae SelO-mediated AMPylation, izay manangana ny fananganana AMP mifandray O amin'ny Ser, Thr, na Tyr residues Peptide adduct ( 22), ary ny S. typhimurium YdiU dia mamorona O-mifamatotra (miaraka amin'i Tyr) sy N-mifamatotra (miaraka Aminy) peptide-UMP fanampiny.Ny fampahalalana voafetra misy ao amin'ny fianakavian'ny proteinina SelO dia manondro fa ny mpikambana ao amin'io fianakaviana proteinina lehibe io dia samy hafa be amin'ny fananganana peptide-NMP fanampiny.Ity dia fanamarihana mahaliana izay mendrika ny fandalinana fanampiny.
Ny angon-drakitra azo tamin'ity fanadihadiana ity dia nitarika antsika hihevitra fa ny NMPylation ny nsp9 dia mitaky N-terminus maimaim-poana.Ao anatin'ny tontolon'ny replication virtoaly, izany dia homena amin'ny alàlan'ny fizarazarana proteolytika amin'ny tranokala fanodinana nsp8 | nsp9 ao amin'ny polyprotein pp1a replicase navoakan'ny Mpro sy pp1ab.Amin'ny ankamaroan'ny coronaviruses, ny fahasamihafana misy eo amin'ity tranokala manokana ity (VKLQ|NNEI ao amin'ny HCoV-229E) sy ireo tranokala cleavage Mpro coronavirus hafa rehetra dia ny Asn (fa tsy ny sisa tavela kely hafa, toa an'i Ala, Ser na Gly) dia mibodo P1â???Toerana (36).Ny angon-drakitra cleavage peptide azo tamin'ny fanadihadiana tany am-boalohany dia naneho fa ny fahombiazan'ny cleavage ny tranokala nsp8|nsp9 dia ambany noho ny an'ny tranokala hafa, izay manondro fa 1) ity tranokala manokana ity dia mety manana anjara andraikitra amin'ny fanodinana ara-potoana ny C-terminal. faritra pp1a, na 2) a Ny andraikitry ny nsp9 N-terminus voatahiry manokana amin'ny replication virus (37).Ny angon-drakitray (sary 5A) dia naneho fa ny endrika recombinant nsp9 mitondra ny tena N-terminal filaharana dia nahomby tamin'ny NMPized nsp12.Ny filaharan'ny flanking N-terminal dia nesorina tamin'ny factor Xa (nsp9-His6; SI appendix, Table S1) na Mpro-mediated cleavage (nsp7-11-His6; Figure 5A sy SI appendix, Table S1).Ny zava-dehibe indrindra, ny nsp9-nsp9-misy mpialoha lalana nsp7-11-His6 dia naneho fanoherana ny NMPylation ny nsp12, izay mifanaraka amin'ny angon-drakitray, izay manondro fa ny adduct nsp9-NMP dia miforona amin'ny alàlan'ny amine voalohany N-terminal (SI appendix, Figure S5) .Mba hahazoana fahatakarana lalindalina kokoa ny mari-pahaizana substrate NiRAN, dia nifantoka tamin'ny sisa tavela N-terminal nsp9 izahay.Amin'ny tsy fisian'ny proteinina hafa, dia mora levona izy ireo, manakana azy ireo tsy ho hita amin'ny endrika tsy misy marika nsp9 (26 28, 38), izay manondro ny fiovaovany voajanahary voafetra. Ny asan'ny ampahany nsp9 N-terminal.Ny fanoloana ala amin'ny sisa tavela amin'ity faritra ity (sary 5C sy D ary SI appendix, sary S8) dia manambara fa ny N3826 dia tena ilaina amin'ny nsp9 NMPylation in vitro, raha ny fanoloana ny N3825A sy E3827A dia mitarika amin'ny fihenan'ny fihenam-bidy, raha toa kosa ny fanoloana M3829A sy P3830A dia tsy NMPylation. .Tena misy fiantraikany amin'ny nsp9 NMPylation.Na dia eo aza ny fanoloana ny N-terminal Asn (N3825A, N3825S) dia misy fiantraikany antonony ihany amin'ny nsp9 NMPylation sy ny famerenana ny viriosy amin'ny kolontsaina sela (sary 5C sy D), ny famafana ny filaharana sisa tavela amin'ny N-terminal 3825-NN dipeptide Voaporofo fa mahafaty ny viriosy, izay manondro fa ny sisa tavela Asn dia takiana alohan'ny sisa tavela amin'ny N-terminus, indrindra fa ny Asn, na dia toa azo leferina amin'ny ampahany aza ny fanoloana ny sisa tavela (sary 5B, C, ary D).Manatsoaka hevitra izahay fa ny dipeptide 3825-NN, indrindra fa ny sisa tavela N3826 voatahiry sy tena ilaina ao anatin'ny faritry ny coronavirus (SI appendix, sary S6), dia miantoka ny famatorana sy ny orientation ny nsp9 N-terminus ao amin'ny toerana mavitrika an'ny NiRAN.
Ny fanoloana ny Ala (E3827A) ho an'ny Glu voatahiry amin'ny subfamilies rehetra dia mitazona nsp9 NMPylation in vitro fa mahafaty amin'ny viriosy amin'ny kolontsaina sela (sary 5C sy D), izay manondro ny fiasa fanampiny amin'ity ambiny ity, ohatra, amin'ny fifandraisana fototra (NMPylated na tsy miova. ) nsp9 N-terminus sy ireo anton-javatra hafa tafiditra amin'ny famerenana ny viriosy.Ny fiovan'ny Nsp9 dia tsy nisy fiantraikany tamin'ny fizotry ny proteolytika nsp9 na ny nsps mifanakaiky (39) (SI Appendix, Figure S9), izay manondro fa ny phenotypes mahafaty amin'ny fiovan'ny nsp9 maromaro voamarika dia tsy vokatry ny dysregulation ny faritra C proteolytic process-terminal pp1a. .
Ny angon-drakitra etsy ambony dia manome porofo fa aorian'ny fitsaboana amin'ny Mpro-mediated amin'ny tranokala cleavage nsp8|9 ao amin'ny pp1a/pp1ab, ny N-terminus an'ny nsp9 dia azo UMPylated (na novaina ampahany amin'ny NMP hafa).Ankoatr'izay, ny fiarovana tsara ny N-terminus an'ny nsp9 (anisan'izany ny sisa tavela Asn tokana sy tsy miovaova ao amin'ny fianakavian'ny coronavirus) ary ny angon-drakitra momba ny génétique mivadika azo tamin'ity fanadihadiana ity (sary 3E sy 5D) dia nitarika antsika hanatsoaka hevitra fa ny nsp9 NMPylation voalaza. dia mifandraika amin'ny biolojika ary ilaina amin'ny replication coronavirus.Ny vokatra azo avy amin'ity fanovana ity dia mbola hodinihina, ohatra, momba ny hetsika famatorana RNA (2628) voalaza teo aloha (tsy voafaritra) nsp9 (endrika tsy voaova).Ny NMPylation N-terminal dia mety hisy fiantraikany amin'ny fifandraisan'ny nsp9 amin'ny proteinina na RNA substrates na ny fananganana fivorian'ny ambaratonga efatra samihafa.Ireo dia voamarika tamin'ny fandalinana ara-drafitra ary nohamafisina fa mifandraika amin'ny replication amin'ny coronavirus, na dia eo aza ny tsy fisian'ny amin'ity fanovana ity (26- ââ29, 40).
Na dia mbola mila amaritana amin'ny antsipiriany bebe kokoa aza ny mari-pamantarana lasibatra amin'ny sehatra coronavirus NiRAN, ny angon-drakitray dia mampiseho fa tena tery ny lasibatry ny proteinina amin'ny sehatra coronavirus NiRAN.Na dia manohana mafy ny asan'ny NMPylator voatahiry aza ny fitahirizana ny sisa tavela amin'ny toerana mavitrika (8, 16) ao amin'ny sehatra NiRAN an'ny fianakaviana nidovirus rehetra, ny mombamomba ny sisa tavela amin'ny paosin'ny substrate amin'ity sehatra ity. , ary mety tsy mitovy amin'ny fianakaviana samihafa amin'ny tanjona Nidovirales.Torak'izany koa, mbola tsy fantatra ny tanjona mifandraika amin'ny viriosy hafa manana akany.Mety ho orthologs lavitra an'ny nsp9 na proteinina hafa izy ireo, satria ny filaharana ivelan'ny sehatra dimy replicase izay voatahiry amin'ny ankapobeny amin'ny viriosy misy akany dia tsy voatahiry loatra (8), ao anatin'izany ny firafitry ny genome eo anelanelan'ny Mpro sy NiRAN, anisan'izany ny nsp9 dia hita ao amin'ny coronavirus.
Fanampin'izany, tsy azontsika atao ny manilika amin'izao fotoana izao fa manana tanjona fanampiny (anisan'izany ny finday) ny sehatra NiRAN.Amin'ity tranga ity dia ilaina ny manonona fa ny homologues bakteria ao amin'ity proteinina mipoitra NMPylators (NMPylators) (30, 31) dia toa manana "mpandrindra master"?Ny NMP dia manova ny proteinina sela isan-karazany mba hifehezana na hanafoanana ny asan'izy ireo any ambany, ka manana anjara toerana amin'ny dingana biolojika isan-karazany, toy ny valin'ny adin-tsaina sy ny homeostasis redox (22, 33).
Ao amin'ity fandalinana ity (sary 2 sy 4 ary SI Appendix, Sary S3 sy S5), dia afaka nanaporofo izahay fa ny nsp12 dia namindra ny ampahany UMP (NMP) amin'ny toerana tokana (voatahiry) ao amin'ny nsp9, fa ny proteinina hafa dia tsy novaina tao amin'ny ampiasaina Eo ambanin'ny toe-javatra, ny substrate specificity voafaritra tsara (fa tsy malalaka) no tohanana.Mifanaraka amin'izany, raha ampitahaina amin'ny N-terminal nsp9 NMPylation, ny asan'ny NMPylation an'ny nsp12 dia tena ambany, ny fitadiavana azy dia mitaky fotoana lava kokoa amin'ny autoradiography, ary ny fitomboan'ny 10 heny amin'ny fifantohana nsp12 dia ampiasaina.Ankoatr'izay, ny famakafakana MS dia tsy nanome porofo momba ny NMPylation ny nsp12, izay milaza fa ny NMPylation ny tena manokana NiRAN dia (tsara indrindra) hetsika faharoa.Na izany aza, tokony ho marihina fa ny fanadihadiana hafa dia nanome porofo mialoha fa ny satan'ny AMPylation tena an'ny NMPylator bakteria dia mety hifehy ny asan'ny NMPylation amin'ny substrate proteinina hafa (22, 33).Noho izany, ilaina ny fikarohana bebe kokoa hanadihadiana ny mety ho vokatry ny asa atao amin'ny hetsika NMPylation-tena voalaza ho an'ny EAV nsp9 (16) sy ny coronavirus nsp12 (ity fandalinana ity), ao anatin'izany ny fiantraikan'ny chaperone natolotra amin'ny fametahana ny sehatra RdRp C-terminal ( 16)).
Teo aloha, petra-kevitra maromaro momba ny mety ho asa midina amin'ny sehatra nidoviral NiRAN no noheverina, anisan'izany ny RNA ligase, RNA-capped guanylate transferase ary ny proteinina priming activity (16), saingy tsy misy amin'izy ireo no mifanaraka amin'ny asa ambany.Ny fampahalalana azo amin'ireto toerana manaraka ireto dia mitovy amin'ny fotoana tsy misy vinavina fanampiny.Ny angon-drakitra azo tamin'ity fanadihadiana ity dia mifanaraka indrindra amin'ny (saingy tsy afaka manaporofo) fa ny sehatra NiRAN dia tafiditra amin'ny fanombohana ny synthesis RNA-induced proteinina.Nino teo aloha fa ny asan'ny domaine NiRAN ao amin'ny 5??²-RNA capping na RNA ligation reactions dia tsy misy fiantraikany amin'ireo sy ny fanohanan'ny angona hafa.Noho izany, ohatra, ny toerana mavitrika amin'ny NiRAN dia heverina ho tafiditra amin'ny Asp voatahiry ho fototra ankapobeny (D252 ao amin'ny Pseudomonas syringae SelO; D4271 ao amin'ny HCoV-229E pp1ab; D208 ao amin'ny SARS-CoV-2 nsp12) (SI Appendix, sary 2. ).S2) (17, 22, 33), raha ny catalyse ao amin'ny ligase RNA miankina amin'ny ATP sy ny enzyme capping RNA dia entin'ny covalent enzyme-(lysyl-N) -NMP intermediate, izay misy sisa Lys tsy miova ( 41).Ho fanampin'izany, ny mari-pamantarana miavaka mifototra amin'ny coronavirus NiRAN ho an'ny kendrena proteinina voatahiry ary ny mari-pamantarana milamina ho an'ny mpiara-miombon'antoka NTP (aleo UTP) dia manohitra ny fiasan'ny enzyme capping-mediated NiRAN na ny RNA ligase.
Mazava ho azy fa ilaina ny asa fanampiny maro hanamarinana ary, raha voaporofo, dia manazava ny mety ho anjara asan'ny nsp9-UMP (nsp9-NMP) amin'ny proteinina-induced RNA synthesis, izay hampifandray ireo tatitra mahaliana maro saingy (hatramin'izao) voalaza teo aloha. .Fandinihana mitoka-monina.Ohatra, nofaritana fa ny fiafaran'ny RNA ratsy amin'ny coronavirus dia manomboka amin'ny tady oligo (U) (42, 43).Ity fandinihana ity dia mifanaraka amin'ny hevitra fa ny synthesis ny RNA négatif dia atomboka amin'ny famatorana ny endrika UMPylated nsp9 amin'ny rambony poly (A) ( triggers), izay mety hampiroborobo ny fatorany RNA Ny hetsika sy / na ny fifandraisana amin'ny. proteinina RTC hafa.Ny ampahany UMP nomen'ny nsp9 dia azo ampiasaina ho "primer" ho an'ny oligouridylation nsp7/8/nsp12-mediated, amin'ny fampiasana ny rambony 3??²-poly(A) ao amin'ny RNA génomique na oligo hafa (A) -misy filaharana. dia toy ny maodely, mitovy amin'ny mekanika napetraka ho an'ny proteinina VPg picornavirus (44).Ahoana raha "non-normative" ny soso-kevitra????Ny fanombohana ny synthesis RNA négatif (ampidiran'ny proteinina) dia manome rohy mankany amin'ny fandinihana, izay manondro fa ny RNA-negatif coronavirus dia manana UMP (fa tsy UTP) amin'ny farany (42), izay heverina fa manondro fa ny asidra nukleika Dicer manapaka ny farany phosphorylated amin'ny uridine-specific endonuclease tsy fantatra.Raha voamarina, ity hetsika hydrolytika asidra nokleika ity dia afaka manampy amin'ny famoahana ny endrika oligomeric UMPylated an'ny nsp9 avy amin'ny faran'ny 5 ² amin'ny tady ratsy vao teraka.Ny mety ho anjara asan'ny nsp9 amin'ny famokarana proteinina dia mifanaraka amin'ny fandalinana génétique teo aloha, izay naneho fa nsp9 (sy nsp8) dia mifandray tsara ary manokana amin'ny singa cis-acting RNA voatahiry eo akaikin'ny faran'ny 3 amin'ny génome coronavirus.45).Araka ny voalazan'ity tatitra ity dia azo averina jerena sy itarina amin'ny alalan'ny fikarohana bebe kokoa ireo fanamarihana teo aloha ireo.
Raha fintinina, ny angon-drakitray dia namaritra ny hetsika manokana amin'ny mari-pamantarana anzima otrik'aretina manana nested mifandray amin'ny RdRp ao amin'ny N-terminus.Ao amin'ny coronavirus, ity hetsika UMPylator/NMPylator vao hita NiRAN-mediated ity dia ampiasaina hiantehitra amin'ny Mn2+ sy ny sisa tavela amin'ny Asn ary mahatonga ny fananganana fatorana phosphoramidate (ambany angovo) miaraka amin'ny amine voalohany N-terminal.Amin'ny alàlan'ny cleavage Mpro-mediated amin'ny tranokalan'ny cleavage nsp8|9, ny kendrena nsp9 dia azo ampiasaina amin'ny NMPylation, manondro ny fifandraisana miasa eo amin'ny protease sy ny sehatra NiRAN, izay miitatra amin'ny RdRp.Ny fitehirizana ny sisa tavela ao amin'ny tranokala mavitrika nsp12 NiRAN sy ny kendrena nsp9, miaraka amin'ny angon-drakitra azo avy amin'ny coronaviruses roa anisan'izany ny SARS-CoV-2, dia manome porofo matanjaka fa ny nsp9 NMPylation dia coronavirus Ny endri-javatra mpandala ny nentin-drazana dia dingana lehibe amin'ny famerenan'ny virus ihany koa.Ny angon-drakitra misy dia mitarika antsika hanatsoaka hevitra fa ny anjara andraikitra manokana amin'ny endrika NMPylated an'ny nsp9 amin'ny synthesis RNA vokatry ny proteinina dia toe-javatra mety ho an'ny coronavirus sy ny viriosy hafa misy akany, ary ny NiRAN dia mety mikendry proteinina hafa tsy fantatra ihany koa.Afehezo ny viriosy.Fifandraisana amin'ny mpampiantrano.Raha voamarina, ny fandraisan'ny proteinina primers amin'ny virosy RNA synthesis dia hampitombo ny fizotry ny fizotry ny sehatra Mpro/3CLpro sy RdRp eo anelanelan'ny coronavirus efa hita teo aloha sy ny supergroup (9) mitovy amin'ny picornavirus (9), izay efa tafatambatra ao amin'ny Pisonivirites vao haingana. 46) ao amin'ny sokajy.
Ny angon-drakitray koa dia mampiseho fa ny hetsika anzima fototra, mifantina ary mpandala ny nentin-drazana hita amin'ity fanadihadiana ity dia azo ampiasaina ho lasibatra amin'ny fanafody antiviral.Ny kanto izay manelingelina ny famatorana (sy ny fanovana manaraka) ny nsp9 N-terminus voatahiry ao amin'ny toerana mavitrika an'ny NiRAN dia azo amboarina ho fanafody antiviral mahomby sy azo ampiasaina, mety amin'ny fitsaboana ny coronaviruses amin'ny biby sy ny olombelona avy amin'ny Infections (sub) karazana. , anisan'izany ny SARS-CoV-2 sy Coronavirus Syndrome Respiratory Middle East.
Ny filaharan'ny kaody proteinina coronavirus novokarina tamin'ity fanadihadiana ity dia nohamafisin'ny RT-PCR tamin'ny fampiasana RNA mitoka-monina amin'ny Huh-7 voan'ny HCoV-229E na Vero E6 voan'ny SARS-CoV-2, ary nampidirina tamin'ny alàlan'ny fomba fanao kloning.pMAL-c2 (New England Biological Laboratory) na pASK3-Ub-CHis6 (47) expression vector (SI Appendix, Tables S1 sy S2).Ny fanoloana codon tokana dia nampidirin'ny mutagenesis mifototra amin'ny tranokala mifototra amin'ny PCR (48).Mba hamokarana ny proteinina fusion MBP, ny sela E. coli TB1 dia niova tamin'ny fananganana plasmid pMAL-c2 mety (SI appendix, Table S1).Ny proteinina fusion dia nodiovina tamin'ny chromatography amylose affinity ary notapatapahina tamin'ny factor Xa.Avy eo, ny proteinina C-terminal His6-tagged dia nodiovin'ny Ni-immobilized metal affinity chromatography (Ni-IMAC) araka ny voalaza teo aloha (49).Mba hamokarana ny proteinina fusion ubiquitin, ny sela E. coli TB1 dia nampiasa ny fananganana plasmid pASK3-Ub-CHis6 mety (SI Appendix, Tables S1 sy S2) ary ny ADN plasmid pCGI manangana ubiquitin-specific C-terminal hydrolase 1 (Ubp1).Fiovana (47).Ny proteinina coronavirus misy marika C-terminal His6 dia nodiovina araka ny voalaza teo aloha (50).
Ny fitsapana NMPylation tena an'ny HCoV-229E nsp12-His6 dia natao araka ny voalaza ao amin'ny EAV nsp9 (16).Raha fintinina, ny nsp12-His6 (0.5 µM) dia misy 50 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) -KOH, pH 8.0, 5 mM dithiothreitol (DTT), 6 mM MnCl2, 25 µM buffer ny NTP voafaritra sy ny 0,17 µM dia nifanaraka tamin'ny [α32-P]NTP (3,000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) tamin'ny 30 °C nandritra ny 30 minitra.Ao amin'ny fitsapana NMPylation hafa (manara-penitra) an'ny nsp12-mediated nsp9 NMPylation, ny fepetra fanehoan-kevitra dia amboarina toy izao manaraka izao: nsp12-His6 (0.05 µM) ary nsp9-His6 (4 µM) eo anatrehan'ny 50 mM HEPES-KOH (pH 8.0). ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM manondro NTP, ary 0,17 µM mifanitsy amin'ny [α32-P]NTP.Taorian'ny incubation nandritra ny 10 minitra tamin'ny 30 ° C, ny santionan'ny fanehoan-kevitra dia nifangaro tamin'ny SDS-PAGE santionany buffer: 62.5 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane HCl (pH 6.8), 100 mM DTT, 2.5% SDS, 10% glycerol ary 0.005% bromophenol manga.Ny proteinina dia nodiovina tamin'ny hafanana 90 ° C nandritra ny 5 minitra ary nisaraka tamin'ny 12% SDS-PAGE.Ny gel dia raikitra ary voaloto amin'ny vahaolana Coomassie Brilliant Blue (40% methanol, 10% acetic acid, 0.05% Coomassie Brilliant Blue R-250), mipoitra ary mipoitra amin'ny efijery phosphorescent mandritra ny 20 ora (mba hahitana nsp12 avy amin'ny NMPylation) na (farafahakeliny) 2 Ora (mba hanombanana ny nsp9 NMPylation).Ny imager Typhoon 9200 (GE Healthcare) dia nampiasaina hijerena ny efijery ary ny ImageJ dia nampiasaina handinihana ny hamafin'ny famantarana.
Ho an'ny fanadihadiana MS, 1 µM nsp12-His6 sy 10 µM nsp9 (tsy misy hexahistidine tag) dia nampiasaina tamin'ny famakafakana NMPylation (SI appendix, Table S1) ary nampiasaina ny fitomboan'ny 500 µM UTP sy GTP.Miankina amin'ny fifantohana sy ny kalitaon'ny proteinina andrasana, ny rafitra HPLC Waters ACQUITY H-Class misy tsanganana MassPrep (Waters) dia nampiasaina mba hanala ny 1 hatramin'ny 10 µL amin'ny vahaolana proteinina buffered amin'ny Internet.Ny proteinina tsy misy sira dia arotsaka ao amin'ny loharanon'ny ion electrospray an'ny Synapt G2Si mass spectrometer (Rano) amin'ny alàlan'ny gradient amin'ny buffer A (rano / 0,05% asidra formic) sy buffer B (acetonitrile / 0,045% asidra formic), ary ny mari-pana amin'ny tsanganana dia 60 ° C ary ny tahan'ny fikorianan'ny 0.1 mL/min: elution isocratically amin'ny 5% A mandritra ny 2 minitra, avy eo ny linear gradient ho 95% B ao anatin'ny 8 minitra, ary mihazona 95% B mandritra ny 4 minitra hafa.
Ny ion tsara misy 500 hatramin'ny 5000 m/z dia hita.Ny Glu-fibrinopeptide B dia refesina isaky ny 45 segondra ho an'ny fanitsiana faobe mandeha ho azy.Mampiasà rindrankajy fitaovana MassLynx miaraka amin'ny fanitarana MaxEnt1 mba hanesorana ny salan'isa antonony aorian'ny fanesorana ny tsipika fototra sy ny fanamafisam-peo.
Ny UMPylated HCoV-229E nsp9 dia levonina tamin'ny fampidirana trypsin (Serva) novaina amin'ny sequencing ary natsofoka nandritra ny alina tamin'ny 37 ° C.Ny tsanganana miodina Chromabond C18WP (ampahany 730522; Macherey-Nagel) dia nampiasaina hanesorana sy hampifantohana ny peptides.Farany, levona tao anaty rano 25 µL ny peptide, izay misy acetonitrile 5% sy asidra formic 0,1%.
Ny santionany dia nodinihina tamin'ny MS tamin'ny fampiasana ny Orbitrap Velos Pro mass spectrometer (Thermo Scientific).Ny rafitra HPLC nanoâ farany indrindra (Dionex), miaraka amin'ny 50 sm mirefy farany??75 μm C18 RP tsanganana feno vakana magnetika 2.4 μm (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Mifandray amin'ny spectrometer faobe amin'ny Internet amin'ny alàlan'ny loharano Proxeon nanospray;tsindrona 6 µL ny fandevonan-kanina trypsin ao anaty savaivony anatiny 300 µm ×??1 sm C18 PepMap tsanganana alohan'ny fifantohana (Thermo Scientific).Amin'ny fampiasana rano / 0,05% asidra formic ho solvent, dia voafandrika ho azy ny santionany ary nodiovina tamin'ny tahan'ny 6 µL / min.
Ireto ambany ireto ny gradients ny rano/0,05% formic asidra (solvent A) sy 80% acetonitrile/0,045% formic asidra (solvent B) dia nampiasaina mba hanatratrarana ny fisarahana ny tryptic peptides amin'ny hafainganam-pandehan'ny 300 nL/min: 4% B ho 5 minitra, avy eo 30 A linear gradient ho 45% B ao anatin'ny minitra, ary ny linear fitomboana ho 95% solvent B ao anatin'ny 5 minitra.Ampifandraiso amin'ny nano-emitter (Proxeon) ny tsanganana chromatographique, ary atsipazo ny eluent mivantana amin'ny capillary mafana amin'ny spectrometer faobe amin'ny alàlan'ny mety ho 2,300 V. miaraka amin'ny angon-drakitra telo farafahakeliny MS / MS scans, dynamically nesorina nandritra ny 30 segondra, mampiasa linear ion fandrika fifandonana induced dissociation na angovo ambony fifandonan'ny dissociation miaraka amin'ny orbitrap detection, Ny vahaolana dia 7,500.
Fotoana fandefasana: Aug-03-2021